استخراج RNA

استخراج RNA یکی از مراحل اساسی در اکثر تحقیقات انجام شده در زمینه miRNA است. روشهای متفاوتی برای استخراج RNA تام وجود دارد اما فقط برخی از آنها می توانند RNA های کوچک مولکول را حفظ کرده و استخراج نمایند. دستورالعمل زیر برای استخراج RNA تام حاوی  miRNA بهینه سازی و آزموده شده است. این دستورالعمل برای محلولهای استخراج با پایه گوانیدین ایزوتیوسیانات- فنل: کلروفرم قابل استفاده است.     گام اول: لیز و هموژنیزاسیون الف: سلولهای چسبنده - محیط کشت سلولها را جمع کرده و سلولها را با میزان کافی PBS بشویید. - PBS را جمع کرده و برای هر دیش ۱۰ سانتی متری ۱ میلی لیتر TRIzol را به پلیت کشت سلول اضافه نمایید. - به آرامی به دیش کشت سلول ضربه زده و به مدت ۵ دقیقه بافر را در اطراف پلیت بچرخانید. - لیزت سلولها را به یک میکروتیوب تمیز منتقل نمایید. ب: سلولهای غیر چسبنده - سوسپانسیون سلولی را به یک لوله  منتقل نمایید. - به مدت ۵ دقیقه در دور ۱۵۰۰  rpm  سانتریفوژ نمایید تا سلولها رسوب نمایند. - سوپرناتانت را دور بریزید. - یک میلی لیتر TRIzol را به رسوب اضافه کنید.   به خاطر داشته باشید که: رسوب سلولها را می توانید حداکثر به مدت ۲ هفته در دمای ۷۰- درجه سیلسیوس نگهداری نمایید. رسوب سلولهای منجمد  را قبل از استخراج ذوب نکنید. محلول TRIzol را مستقیما به رسوب منجمد سلولها اضافه کنید. ج: نمونه بافت - به ازای هر ۵۰-۱۰۰  میلی گرم از نمونه بافت ۰٫۷۵ میلی لیتر TRIzol به نمونه اضافه کنید. - با استفاده از یک هموژنایزر نمونه را هموژنیزه نمایید. در مورد نمونه بافت، بلافاصله بعد از جمع آوری نمونه مراحل استخراج را شروع نموده یا بافت را منجمد کنید. د: نمونه ادرار و سرم - نیم میلی لیتر از نمونه را با آنزیم پروتئیناز K تیمار نمائید (به روش دستورالعمل کمپانی تولید کننده آنزیم). - به ازاء هر ۰٫۲۵ میلی لیتر از حجم نمونه ۰٫۷۵ میلی  لیتر TRIzol-LS اضافه کنید. - مخلوط حاصل را چندین بار پیپتاژ نمایید.   گام دوم: جداسازی فازها - نمونه هموژنیزه حاصل را به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری نمایید. - به ازاء هر ۰٫۷۵ میلی لیتر از TRIzol اضافه شده به نمونه ۰٫۲ میلی لیترکلروفرم اضافه نمایید. - درب تیوب را بسته و به مدت ۱۵ ثانیه محکم با دست تکان دهید. - به مدت ۱۲-۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار دهید. - میکروتیوب را به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سیلسیوس با دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ نمایید. - مخلوط تشکیل ۳ فاز جداگانه را خواهد داد: فاز فنل کلروفرم (آلی) پایینی،  فاز میانی و فاز آبی بالایی. RNA در فاز بالایی قرار دارد. - فاز آبی را با دقت جدا کرده و در تیوب جداگانه ای بریزید. دقت کنید آلودگی با فازهای دیگر ایجاد نشود.   گام سوم: رسوبدهی RNA - به ازاء هر ۱ میلی لیتر TRIZOL اولیه، ۰٫۵ میلی لیتر اتانل ۱۰۰% اضافه نمایید. - نمونه را به مدت ۱ شب در دمای ۲۰- درجه سیلسیوس انکوبه نمایید. - میکروتیوب را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سیلسیوس با دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ نمایید.   در مورد نمونه های غیر مایع شما همچنین می توانید: - به ازاء هر ۱ میلی لیتر TRIZOL اولیه، ۰٫۵ میلی لیتر ایزوپروپانول اضافه نمایید. - نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۱۵ تا ۳۰ درجه سیلسیوس انکوبه نمایید. - میکروتیوب را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سیلسیوس با دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ نمایید.     گام ۴: شستشو و محلول سازی RNA - سرریز را دور بریزید. - به ازاء هر ۰٫۷۵ میلی لیتر TRIzol  اولیه، ۱ میلی لیتر اتانول ۷۵%  به رسوب RNA اضافه نمایید. - نمونه را ورتکس کنید. - میکروتیوب را به مدت ۵  دقیقه در دمای ۴ درجه سیلسیوس با دور g 7500 سانتریفوژ نمایید. - رسوب RNA را  به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه در دمای اتاق خشک کنید. - رسوب RNA را با افزودن ۲۰ تا ۵۰ میکرولیتر آب RNase-free  و پیپتاژ کردن حل نمایید. - میکروتیوب را به مدت ۱۰ تا ۱۵  دقیقه در حمام آب با دمای ۵۵ تا ۶۰ درجه سیلسیوس انکوبه کنید. بعد از این مرحله نوبت به استفاده از محصولات می باشد Real-time PCR تکثیر microRNA به کمک Real-time PCR یکی از پر کاربردترین تکنیک ها در حوزه تحقیقاتی microRNA می باشد. اساس این تکنیک مشابه روشهای معمولی Real-time PCR می باشد، با این تفاوت که به واسطه کوچکی اندازه microRNAها راهکارهای خاصی برای این منظور ارایه شده است. افزودن یک دم polyA به miRNAهای مورد نظر یکی از این شیوه هاست که درکیت PARSGENOME MiR-Amp kit نیز از همین روش برای تکثیر miRNAها استفاده شده است.   مشخصات کیت  Real-time PCR نکته: در این پروتکل مراحل افزودن مواد مصرفی و انجام واکنش ها به کمک سیستمی از شماره بندی ها و برچسب های رنگی (به همان ترتیب که بر روی میکروتیوب های کیت آمده است) نشان داده شده است. روش تکثیر miR با استفاده از کیت PARSGENOME MiR-Amp شامل یک پروتکل سه مرحله ای به شرح زیر می باشد: ۱) مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase 2) سنتز رشته اول cDNA 3) تکثیر به روش Real-time PCR ———–   1) مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase نکته: استخراج RNA می بایستی به روشی صورت پذیرد که RNAهای با سایز کوچک را بتواند حفظ کند (برای اطلاعات بیشتر به پروتکل استخراج miRNA موجود در سایت پارس ژنوم مراجعه کنید). توصیه می شود که از میکروتیوبها و سرسمپلرهای RNase free استفاده شود. حمل و نقل مواد مصرفی و انجام واکنشها همواره بر روی یخ ( دمای ۴ºC) انجام شود. روش اجرا: تمامی مواد فوق با کمک پیپت کردن به آرامی با یکدیگر مخلوط شده و در نهایت اسپین شود. واکنش فوق در دمای  Cº37 و به مدت ۱۰ دقیقه انکوبه شود. نکته: - در صورت لزوم محصول واکنش فوق را می توان در فریزر Cº80- و حداکثر تا ۶ ماه نگهداری کرد. - محصول نهایی را می توان تا چند مرحله رقیق سازی نمود. در مورد ژن های با بیان بالا این عمل توصیه می شود.   2) سنتز رشته اول cDNA روش اجرا: همه مواد فوق با کمک پیپت کردن به آرامی با یکدیگر مخلوط شده و در نهایت اسپین شود. واکنش فوق در دمای ۴۳-۴۵ºCبه مدت ۶۰ دقیقه انکوبه شود انکوبه کردن در دمای ۸۵ºC به مدت ۱ دقیقه (غیرفعال کردن RT) نکته: - محصول فوق قابل نگهداری در فریزر ºC20- به مدت حداکثر ۲ ماه می باشد. - محصول نهایی را میتوان تا چند مرحله با آب دپک رقیق سازی نمود. در مورد سلولها و یا بافتهای با بیان بالای microRNA این عمل توصیه می شود. - توصیه می شود عمل رقیق سازی درست قبل ازمرحله real-time PCR انجام شده و cDNA به میزان مورد نیاز با آب دپک رقیق شود.   3) تکثیر به روش Real-time PCR نکته:  - ویالهای مربوط به SYBER Green master mixرا بدور از نور نگهداری نموده و بلافاصله قبل از استفاده با سر و ته کردن ویال, محتویات تیوب را مخلوط کنید. سایر مواد به کمک ورتکس و اسپین سریع، آماده مصرف می گردند. - توجه داشته باشید که SYBR Green master mix فاقد رنگ ROXمی باشد. میزان ROX مصرفی با توجه به نوع دستگاه PCR متفاوت است. - به دلیل امکان حضور مهار کننده های واکنش PCR،حداکثر میزان مجاز استفاده از cDNA درPCR ، ۱۰% از حجم غیر رقیق شده اولیه می باشد.   مراحل انجامPCR                                                                   دما و  مدت زمان ۱ سیکل  واسرشتی                                                       95درجه سانتیگراد، ۵دقیقه                                                                                    95درجه سانتیگراد، ۵ثانیه           40 سیکل تکثیر                                                         60-62درجه سانتیگراد، ۲۰ثانیه                                                                                    72درجه سانتیگراد، ۳۰ثانیه  

سلول بنیادین...